[實驗] 動生實驗6：免疫組織螢光染色1

學期：107-2
課程：動物生理學實驗 Animal Physiology Laboratory
老師：李昆澤 Kun-Ze Lee
主題：免疫組織螢光染色
系所：國立中山大學生物科學系

一、實驗目的

學習冷凍切片與免疫組織螢光染色技術，並透過免疫螢光染色來定位與量化目標物的位置與數量。

二、材料與方法

（一）材料

冷凍切片：冷凍切片劑 (frozen section compound, FSC)、冷凍切片機。
免疫組織螢光染色：73%酒精、95%酒精、PBS （洗滌劑）、3%雙氧水、5 % NHS（blocking solution）、tPBS （洗滌劑）、一抗、二抗、載玻片、DAPI（封合膠兼細胞和染劑）、蓋玻片、螢光顯微鏡。

大鼠大腦：GFAP (GA5) mouse mAb + Alexa Fluor 488-conjugated affinipure donkey anti-mouse IgG (H+L)
大鼠小腦：Anti-Choline Acetyltransferase + Alexa Fluor 594-conjugated affinipure donkey anti-rabbit IgG (H+L)
大鼠脊髓：Anti Iba1 + Alexa Fluor 594-conjugated affinipure donkey anti-rabbit IgG (H+L)

冷凍切片劑 (frozen section compound, FSC)

冷凍切片機

螢光顯微鏡1

螢光顯微鏡2

螢光顯微鏡3

（二）方法

冷凍切片：將上次儲存於保存劑中的中樞神經拿出來，使用刀片切下要切片的部分，並將之用冷凍切片劑固定於紙片上，再套上吸管並填充冷凍切片劑於管內，然後放置於冷凍切片機內冷凍凝固。當冷凍切片劑完全凝固後，將吸管套抽出並將樣本固定於切片圓座上，而後置於切片機上並喬好切片座角度與鎖緊切片座鎖緊紐，接下來將刀片裝於刀片座上並鎖緊切片座鎖緊紐，然後蓋上防捲片，使切片不會捲起，即可開始進行切片，之後切下來的冷凍組織切片放在裝有PBS的微量離心管中浸泡。
免疫組織螢光染色第一天：抽液併並加入1ml 73% 酒精10分鐘，抽液並加1ml 95% 酒精10分鐘，抽液並加1ml PBS 2分鐘，抽液並加1ml 3%雙氧水15分鐘，抽液並加1ml PBS 5分鐘重複3次，抽液並加150 μl 5%NHS 1小時，抽液並加1ml tPBS 5分鐘重複4次，最後抽液並加150 μl 稀釋好的一抗置於4 ℃冰箱隔夜約12-18小時。
免疫組織螢光染色第二天：抽液並加1ml tPBS 5分鐘重複4次，抽液並加150 μl 5%NHS 1小時，抽液並加1ml tPBS 5分鐘重複4次，抽液並加150 μl 稀釋好的二抗 2小時，抽液並加1ml tPBS 5分鐘重複3次，然後將切片貼於載玻片上，並於載玻片上塗於DAPI，最後蓋上蓋玻片，即可拿到螢光顯微鏡下觀察並注意要避光。

等待冷凍切片液凝固中1

等待冷凍切片液凝固中2

被冷凍切片劑包埋的大鼠小腦切片

被冷凍切片劑包埋的大鼠大腦切片

大鼠脊髓切片

大鼠小腦切片

三、結果

一抗：Anti Iba1
二抗：Alexa Fluor 594-conjugated affinipure donkey anti-rabbit IgG (H+L)

（一）IBA-1 / AIF-1簡介

所使用的一抗是Anti Iba1，離子鈣結合銜接分子1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1, IBA1)也稱為同種異體移植發炎因子 (allograft inflammatory factor 1, AIF-1)，在人類中是由AIF1基因所表達的蛋白質。

（二）IBA-1 / AIF-1分布

IBA-1 / AIF-1 mRNA表現量

AIF1基因在睪丸 (testis)、脾臟 (spleen)與腦 (brain )中高度表現，而在肺 (lung)與腎 (kidney)中表達較弱，然而在腦中微膠細胞 (microglia)特別強烈表現IBA1，且在循環系統的巨噬細胞 (macrophages )也會表現。

從IBA-1 / AIF-1 mRNA表現量圖中，可以發現左邊亮藍色柱狀圖顯著高於其他顏色，而這色塊主要是免疫系統的白血球；第二高的顏色是右邊淡綠色柱狀圖，而這色塊是白色球發育生長的淋巴器官：骨髓、胸腺與淋巴結；第三高的色塊是綠色，而這色塊主要是中樞神經。

這次我染色的樣本是大鼠的中樞神經，在IBA1 mRNA表現量中，脊髓＞大腦＞小腦，因此我選用脊髓來染一抗 (Anti Iba1)。

（三）IBA-1 / AIF-1功能

從以上分布分析的結果中，顯示IBA-1 / AIF-1與免疫功能似乎有極大的關係。當微膠細胞與巨噬細胞被活化後，其蛋白的表現量也會隨之上升。因此，當中樞神經受損後，腦中的微膠細胞IBA-1 / AIF-1蛋白量也會隨之增加。IBA-1 / AIF-1存在於被活化的巨噬細胞中，而在發炎的組織中會發現被活化的巨噬細胞，因此IBA-1 / AIF-1可能是體內巨噬細胞活化的標誌物。

值得一提的是，AIF1也被證明可促進內皮細胞的增殖和活化。內皮細胞活化導致細胞的增殖和遷移，其涉及多種正常血管過程，例如動脈粥樣硬化，血管生成和傷口癒合。