大三進實驗室：實驗室的各種所學

我在王聖帆老師這所學到的技術與廖志中老師那所學到的技術完全不一樣，從廖老師那學到比較偏細菌與萃取的技術；而王老師這學到比較偏細胞、病毒、分生的技術。總體而言，完全沒有重疊，彼此還互相互補，且補足我沒學到分生技術的小小遺憾。

此篇章會著重在技術層面的介紹，而以下的技術算是微觀生物學實驗中，常用的經典技術，也是書中課本會出現的技術。

三、所學技術

三大技術時數概況

在王聖帆老師這學習時數約91小時，主要著重在細胞培養與分生技術上，其次才是整理筆記與每周的開會。

（一）BCRC小教室

BCRC小教室

在進入正式介紹前，我先介紹一個非常實用的微生物實驗網站－BCRC小教室，它裡面收錄了在微生物實驗室裡常用的基礎技術。我在整理筆記時，這個網站給我很大的幫助。以下是此網站的宗旨：

成立BCRC小教室的目的是協助使用BCRC所提供之生物資源時，對於常面臨的實驗操作問題，提供完整的解答。同時也希望經由小教室的宣導，減少操作不當而浪費寶貴的時間與資源。

我們不是老師，也不是大學教授，只是一群有經驗的研究人員，在生物資源的研究領域上，希望成為知識的燈塔，指引更多樂於研究與學習者，珍貴的學習經驗與豐富的知識分享。

（二）細胞/病毒培養

MDCK（犬腎上皮細胞）貼壁細胞

技術：繼代培養、種/數/凍/解細胞、病毒感染、收病毒

我所經手的病毒是流感病毒，而病毒必須在宿主體內，才會有完整的生命現象。因此，在培養病毒之前，一定要先培養其宿主細胞，其技術稱為繼代培養。培養流感病毒常用的宿主細胞有很多種，而我所使用的宿主細胞是MDCK（犬腎上皮細胞），它是一種貼壁細胞。

宿主細胞都培養完後，再將流感病毒感染下去，數日再將培養成功的病毒分離出來，並置於冷凍庫中保存。然而，宿主細胞是無法依職繁殖下去的，所以就必須再次活化細胞，而我們所使用的技術為活化細胞。最後，如果要將細胞長時間保存，則使用冷凍細胞技術。

在開始培養宿主細胞，我們要考慮到細胞品系、培養基與病毒品系，也就是我們要對宿主細胞與病毒的生命週期有一定的了解。以下是我所使用的材料：

MDCK：犬腎上皮細胞，貼壁細胞。［血清中含有帶正電荷的貼附因子（蛋白質）會吸附於介質（如：塑膠）中，帶負電的細胞在與已附著好的貼附因子連接。］
Medium： DMEM+FBS(9:1) + 糖 + 抗生素。［FBS(胎牛血清)含有Typsin inhibitor］
HBSS(含Mg2+, Ca2+)：洗細胞
Trypsin-EDTA：將貼壁細胞與培養皿底部的鍵打斷，使細胞成懸浮狀。［通常用EDTA和胰蛋白酶對細胞進行消化，一定程度上也是基於這個原理。胰蛋白酶能使laminin,fibronection等粘連蛋白失活，破壞細胞間的連接蛋白，促進細胞從介質上脫落下來。而EDTA是一種螯合劑，可以螯合二價鈣離子和鎂離子，一些粘連蛋白帶有鈣、鎂離子，EDTA螯合鈣、鎂等離子能加速細胞與介質的脫落以及細胞間的分離。］

各項技術的實驗方法在BCRC小教室都有收錄，因此我就不多闡明。以下為連結，有興趣的人可以點進去看：繼代培養、數細胞、冷凍細胞、活化細胞。

（三）分生技術

技術：HA test、抽RNA、RT-PCR、PCR、qPCR、DNA膠體電泳、西方墨點法

1. HA test

HA test 結果
有四個病毒樣本（191, 475, 096, RG），純數字為第一代的病毒價數，a為第二代的病毒價數。1-11的數字為病毒稀釋10倍的指數，其指數越大，病毒感染力越強。(-)為陰性對照組，沒有加入O型血。

HA test全名為Hemagglutination Inhibition Test，主要測病毒的感染力，也就是價數(title)。其實驗原理為凝集反應，詳細的實驗方法請參照此連結。

2. 抽RNA、RT-PCR、PCR、

流感病毒為RNA病毒，而我們抽取病毒的RNA最主要是想拿來定量與鑑種。抽取RNA的核心為破壞病毒、過濾殘渣與高速離心。因RNA在室溫下非常容易裂解，就算在冰庫中也無法保存太久，因此，我們會透過RT-PCR將RNA轉換成cDNA。

這裡的cDNA為單股DNA且與模板RNA互補，RT-PCR的核心就是反轉錄酶，能夠使單股RNA→單股cDNA。我們所拿到的單股cDNA還是無法拿來定量與鑑種，必須再轉成雙股DNA與增加其DNA數量。

最後，我們在使用PCR，將單股cDNA轉成雙股DNA，並放大其數量，這樣的樣本就可以拿來定量與鑑種的工作。

3. qPCR、DNA膠體電泳

我所使用的定量方法為qPCR，其定量原理為透過每個樣本的數量與時間關係圖（即數量放大曲線圖），即可推估各個樣本的原始量，達到定量的目的。我所使用的鑑種方式為NGS，中文叫次世代定序，也就是將處理好的DNA拿去定序，最後再用已知的序列去交叉比對，而達到鑑種的目的。

DNA膠體電泳結果

最後，為了再次確定我所抽到的RNA是對的，我再使用DNA膠體電泳，去求得其DNA的質量。上圖是DNA膠體電泳的結果，我詳細的實驗結果已經不可考了，就只有留下這張圖。

4. 西方墨點法

西方墨點法的用處很多，最主要是在分析蛋白質，其應用大多為檢驗與鑑定。

以上各分生技術的細節，因網路上已經有非常多的資料，且都有SOP，所以有興趣的人可以再去網路上找資料研讀。

（四）單株抗體

技術：單株抗體、融合瘤技術、ELISA、MUNANA

王老師其中一個計劃就是想製備出H7N9的單株抗體，為何是H7N9？因為它是近年來所出現的新型流感病，簡而言之它是一個具有研究潛力的目標，其細節詳見維基百科。

製備單株抗體的細節可以閱讀莊榮輝與吳建興所寫的文章，其概念為將病毒感染於小鼠上，並待於數日，殺小鼠取其脾臟細胞。再使用融合瘤技術，將脾臟細胞與癌細胞融合，製備出能夠無限繁殖和製造出抗體的融合瘤細胞。

最後，使用ELISA與MUNANA這兩個技術，從多個融合瘤細胞中，篩選出我們想要的細胞。ELISA與MUNANA其原理相似，很像是西方墨點法，都是利用抗原會與抗體結合的特性，去分辨誰是我們想要的抗體。

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