[實驗] Protein content assay

一、實驗原理

吸光原理為分子電子躍遷，因蛋白質分子中的羰基與苯環電子躍遷所需的能量剛好落於紫外光的波長，因此蛋白質本身的結構就帶有可吸收紫外光的特性。也可以利用化學染劑結合於蛋白質分子上，形成染劑-蛋白質複合物，且這些複合物本身也具有吸光性。不同的染劑，複合物就會有不同的吸光波長，因此可以使用多種的光源與增加其技術的敏感度。

光吸收的基本定量原理為Beer–Lambert law，吸收介質的濃度愈大，介質的厚度愈大，則光強度的減弱愈顯著。其關係式為吸光度=吸收係數x吸收介質厚度x濃度，因此當吸收係數與吸收介質厚度皆為定值時，就可以利用吸光度與吸收介質濃度成正比的關係，去定量出未知濃度的樣品。

二、實驗步驟

熟悉分光光度計操作方法，並預先熱機15分鐘，再進行儀器操作。取4 mL的Coomassie blue solution到玻璃比色管，並依序將0, 250, 500, 750, 1500μg/mL的蛋白質溶液加入80μL於比色管中。混和均勻後，靜置5~10分鐘，測定595nm波長吸光值。即可得出標準曲線與回歸直線，並將兩館未知樣品之吸光質帶入方程式中，即可求出未知的濃度。

三、實驗結果

#1 - #7 樣品顏色

將濃度0, 250, 500, 750, 1500μg/mL的標準樣品拿去測量並劃出標準曲線，得到y = 0.0007x + 0.0644, R² = 0.9723。並將未知濃度的樣品(#6 & #7)拿去測量，吸收度分別為0.58與0.31，並將之帶入標準曲線中，得到理論濃度為732與344。其中#7實際與理論相差最大，差距為294，已經超出標準樣本的平均絕對離差79.2，因此，我認為#7有人為上的誤差。

各樣品的吸收度、實際濃度與理論濃度，濃度單位：μg/mL。

標準曲線

四、實驗心得

此次實驗其實非常快，只要將標準樣本拿去測量並劃出標準曲線與其公式，並測量出未知濃度樣本的吸光度，再代入公式即可求得理論濃度。但慢在於器材的數量只有兩台，因此必須輪流做實驗。幸好我們這一組集合的情況還不錯，排在第三順位，所以大約三點就做完了。

關於器材只有兩台的問題，其實我想建議助教分成四輪來做實驗，一輪約一小時。前半段讓同學自己摸索並引導他們，後半段再直接教導他們操作器材。這樣人數少且好管理，也可以減少學生們對於實驗的苦悶感。

定量蛋白質所用的試劑CBG與蛋白質染色所用的染劑CBR其實差不多，在分子上只相差一個甲基，而用途也都是用於蛋白質的染色。不知道兩者顛倒的結果會是如何？而且CBG可以拿來當蛋白質濃度的指示劑，不過光是用肉眼根本無法定量出濃度，只能比較出濃度的大小。

五、問題

測定蛋白質含量有兩種主要方法，一種是利用蛋白質本身的物化性質，如紫外光吸收來測定，另一種則以化學染劑顯色測定，如Biuret’s, Lowry’s test, Bradford’s test, BCA test 等。

1. 請問利用紫外光吸收來測定蛋白質濃度的原理為何？

吸光原理為分子電子躍遷，因蛋白質分子中的羰基與苯環電子躍遷所需的能量剛好落於紫外光的波長，因此蛋白質本身的結構就帶有可吸收紫外光的特性。

2.請說明上述化學染劑測定蛋白質含量的原理為何？

化學染劑測定蛋白質的方式與上述所述原理一樣，皆是分子電子躍遷與Beer–Lambert law。其不同點在於此方法電子躍遷的物質不是蛋白質本身，而是染劑-蛋白質複合物。因此所用的光源可以不局限於紫外光，且敏感度可以隨著化學染劑的不同，而有所不同。

3. 比較上述所有方法的差異性（至少五項），請用表格呈現。

四種蛋白質定量法的各個差異
FC reagent: Folin-Ciocalteu reagent, CBG: Coomassie Brilliant Blue G-250, BCA: Bicinchoninic acid

六、引用文獻

莊榮輝。2009。蛋白質定量法。國立台灣大學農業化學系 [2017.05.31]
輔仁大學理工學院生命科學系。2017。蛋白質定量法 [2017.05.31]
TECAN小姐。2009。蛋白質定量方法比一比。隨意窩 [2017.05.31]
WikiPedia. 2017. Biuret test [2017.05.31]
WikiPedia. 2017. Lowry protein assay [2017.05.31]
WikiPedia. 2017. Bradford protein assay [2017.05.31]
WikiPedia. 2017. Bicinchoninic acid assay [2017.05.31]

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