一、摘要
測定不同因子下，酵母菌發酵作用速率的關係與過氧化酵素(peroxidase)之活性的關係，分別藉由發酵作用會產生CO2的特性與在過氧化酵素的催化下，癒創木醇(guaiol)會與H2O2發生變色反應的機制，分別用定量的方式，去找出他們關係。前者發現酵母菌之濃度越高，發酵作用之速率則越快；後者發現蘿蔔萃取液越多，有色物質生成速率則越快，因此酵母菌之濃度／蘿蔔萃取液多寡分別與發酵作用／氧化酵素之活性呈正相關。
二、前言
細胞內有數千種的代謝作用(metabolism)，然而這些代謝作用的能量來源是透過呼吸作用(respiration)而取得的。呼吸作用為細胞將醣類(carbohydrate)、蛋白質(protein)、脂質(lipid)的化學鍵透過一系列的反應打斷並將其化學能移轉至另一個能量載體(energy carrier)再轉移到能量貨幣(energy currency )，因此能量得以繼續用化學能的方式保存起來並被細胞本身利用。細胞內知名的能量載體有菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸(nicotinamide adenine
dinucleotide, NAD+)、菸鹼醯胺腺嘌呤雙核苷酸磷酸鹽（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP+）、三磷酸腺苷(adenosine
triphosphate, ATP)……等等的高能物質。NAD+與NADP+分別用於光合作用與有氧呼吸能攜帶電子的物質並透過電子傳遞鏈釋放出能量，又稱作為電子載體(electron carrier)(
leavingcertbiology, 2016)；ATP的重要性，可說是僅次於DNA(Trefil, 1992,
p.93)，為人體內最為廣泛的高能物質(Ritter, 1996, p.
301)，被公認為全部生物從細菌到人類最為重要的能量貨幣。
ATP產生的地方主要有四個：原核細胞的細胞壁、真核細胞的粒線體與葉綠體、原核與真核的細胞質內，其中原核細胞之細胞膜上可以製造出ATP的蛋白質並無在真核細胞中被發現有其類似結構(Jensen et al., 1997)，因此可以透過這個特徵去辨識原核細胞與真核細胞。順帶一提，因製造ATP的過程十分複雜，所以病毒是無法自身製造ATP(Bergman, 1999)。
真核細胞可以透過粒線體、細胞質或葉綠體來製造ATP，只在細胞質產生ATP的過程稱為無氧呼吸，主要由糖解作用產生ATP；在粒線體產生ATP的過程稱為有氧呼吸，最主要由電子傳遞鏈產生ATP，次要由糖解作用與克氏循環也稱為檸檬酸循環產生ATP；在葉綠體產生ATP的過程稱為光反應，主要由電子傳遞鏈產生ATP。
無氧呼吸包含糖解作用與發酵作用(fermentation)，發酵作用又可細分為乳酸發酵(lactate
fermentation)與酒精發酵(alcoholic
fermentation)，前者常見於動物之肌肉細胞；後者常見於植物與乳酸菌。糖解作用基本原理為在細胞質內，將葡萄糖分解為丙酮酸+ATP+NADH；發酵作用則是利用NADH將丙酮酸還原成其他的有機物，此有機物為酒精+CO2，則稱為酒精發酵；此有機物為乳酸，則稱為乳酸發酵。此實驗是藉由酒精發酵會產生CO2的特性，去測量CO2產生的多寡來代表酵作用的的相對速率。
有氧呼吸包含糖解作用與檸檬酸循環，檸檬酸循環是在粒線體內作用，為一連串的氧化還原反應，其中氧化酵素作用的過程中經常會形成有害於細胞的H2O2，此時，細胞內的過氧化酵素與過氧化氫酵素(catalase)會來處理H2O2，將其轉換成毒性較低的物質。此實驗是藉由經過氧化酵素的催化下，透明無色的癒創木醇會與H2O2發生變色反應（也是一種氧化還原反應），並利用分光光度計去測量岀其生成物的多寡，進而去推估過氧化酵素的活性(陳等，2016)。
三、材料與方法
帶有軟管之1ml量管
|
30℃溫水浴
|
試管
|
分光光度計
|
蒸餾水
|
比色管
|
酵母菌溶液
|
微量滴管
|
葡萄糖溶液
|
燒杯
|
量管
|
癒創木醇
|
橡皮管
|
0.9%過氧化氫
|
燕尾夾
|
氟化鈉溶液
|
白蘿蔔萃取液
|
氯化鈉溶液
|
1.發酵作用：先將四根試管依照表一配置出適當的酵母菌混合液，將上有橡皮管的1ml量管分別置入於各試管當中，再將各試管浸泡至30℃之水浴當中5分鐘，並用燕尾夾夾住橡皮管吸取溶液至量管中，並開始每隔2分鐘記錄一次直到20分鐘後停止。
 |
表一、發酵作用之溶液配方（單位：ml）
|
2.過氧化酵素活性測定：先將蘿蔔原液稀釋200倍至200ml，分光光度計波長調為470nm，0.1ml癒創木醇+0.2ml 0.9% H2O2(aq)+9.7ml蒸餾水作為空白液用。先取5ml的空白液於測光管中進行機器的校正，在依照表二配置出溶液於比色管內，空白液最後要測量其吸收度時再加入，每20秒記錄一次直到5分鐘後停止。
 |
| 表二、過氧化酵素之溶液配方（單位：ml）
B4*：萃取液先至於沸水5分鐘
B5*：加0.25ml,1M,NaF(aq)
B6*：加0.25ml,0.3M,NaCl(aq)
|
四、結果
1.發酵作用：A1與A2都沒有任何變化；A3與A4均有變化，但是A4的變化率大於A3的變化率。（圖一）
 |
| 圖一、CO2產量與時間的作圖，A3、A4由林茂達與葉宇軒提供 |
2.過氧化酵素活性測定：
(1)我方結果：一開始的透光度為B2>B6≒B5≒B1>B4>B3，大部分前期有明顯的下降，到了中期與後期呈現緩和下降甚至停滯，然而，B4有明顯地上升。（圖二）
 |
| 圖二、我方各試管之透光度的作圖 |
(2)歐家滎與李家儀之結果：各組數據都呈現很規律地下降。（圖三）
 |
| 圖三、歐家滎與李家儀各試管之透光度與時間的作圖 |
(3) 陳威行與鄭書華之結果：B4幾乎成水平線，其餘數據都平穩下降。（圖四）
 |
| 圖四、陳威行與鄭書華各試管之透光度與時間的作圖 |
五、討論
A1與A2所顯示出來實驗結果都沒有動靜，因此這兩根試管沒有產生發酵作用，由此可知發酵作用中，酵母菌與葡萄糖缺一不可。比較A3與A4的數據可以發現A4有比較快，因此，酵母菌溶液加越多，產生CO2的速率就越快，兩者關係為正相關。
我方過氧化酵素活性測定的數據會比歐家滎、李家儀的數據高，是因為蘿蔔液沒有稀釋200倍直接用蘿蔔原汁去測定，結果發現我方B1、B2、B4、B5、B6數據在0-40秒內有大幅度地下降，之後就緩和了，可能是因為過氧化酵素早在0-40秒內就已經將大部分的H2O2催化成其他的生成物了，B3則與其他數據完全相反，猜測原因為分光光度計一開始測量到經加熱過後而凝固的酵素懸浮物質，經過時間沈澱後，而透光度漸漸上升。然而，歐家滎、李家儀的數據數據與陳威行、鄭書華的數據比較過後，發現B4、B5、B6的數據皆有差別，前者B4為一條斜線，後者B4為接近水平線的線，依照理論上，經沸水煮過的酵素應該已經變性了，所以不會有太大的活性，因此認為前者並沒有經沸水煮過；前者B5與B6的數據幾乎接近一樣，後者B5斜率大於B6且差異頗大，因此認為前者B5與B6沒有經過特殊的處理，然而前者與後者實驗數據比較後，發現B6的數據皆一致，後者B5斜率較大，因此推斷1M,NaF(aq)不會對過氧化酵素活性有影響，0.3M,NaCl(aq)會降低過氧化酵素活性。事後發現前者並未對B4、B5、B6做特殊的處理。
六、引用文獻
1. 陳韻安，蘇昱任，宋姵瑢，許心瑜。2016 。實驗三、呼吸作用。生物科學系普通生物學實驗。國立中山大學。第12-14頁。
2.
Jensen, Marcus, Donald Wright, and Richard Robinson. 1997. Microbiology for the
health sciences, 4th edition. Prentice-Hall. Upper Saddle River, NJ.
3.
Jerry Bergman. 1999. ATP: The Perfect Energy Currency for the Cell. CRSQ Volume
36(1).
4.
leavingcertbiology online data sheet. 2016. Chapter 10: Energy Carriers (HL
only). leavingcertbiology. http://goo.gl/H1OrCj. Accessed April 2016.
5.
Ritter, Peck. 1996. Biochemistry, a foundation. Brooks/Cole. Pacific Grove CA.
6.
Trefil, James. 1992. 1001 Things everyone should know about science. Doubleday.
New York.
七、附錄
 |
| 表三、各試管之CO2產量，A3、A4由林茂達與葉宇軒提供 |
 |
| 表四、我方各試管之透光度 |
 |
| 表五、歐家滎與李家儀各試管之透光度 |
 |
| 表六、陳威行與鄭書華各試管之透光度 |
留言
張貼留言