一、 摘要
使用四區劃線法可以純化分離出單一菌種，自19世紀柯霍發展出該技術後一直使用至今。四區劃線在不同區會有不同菌落數，第一區呈連續的菌落分布，第四區則形成數個單一菌落。根據四區劃線、斜面接種與深層接種的結果，可以判斷使用的菌液為兼性好氧或厭氧菌。不同環境微生物的密集程度並不相同，以口腔最多而空氣最少。二、 前言
微生物的培養技術，可追溯至19世紀，柯霍開發了許多基本的實驗室技術。使用固體培養基代替液體來製備細菌的培養物。液體培養基容易被其他細菌污染，細菌菌落相互混合，而使用固體培養基，可以保持分離菌落。 柯霍首先使用切片土豆種植細菌，但後來開發了在培養皿中使用瓊脂明膠的技術。開發了動物實驗和實驗病理學的方法。(一) 微生物的分離及菌落的觀察
細菌在自然界中很少單獨存在，常常是很多聚集在一起。為了研究細菌的生殖、遺傳……等，要運用純系分離 (pure culture isolation) 的方法。將一種細菌與其他種類分開，使其單獨培養在培養基中生長繁殖，此為純系分離。讓細菌能在培養基上適當地生存，讓其可以單獨繁殖形成一群細菌，則稱菌落。常用的方法有劃線法 (streaking)、塗佈法 (spreading)、單層倒皿法 (single layer plating) 和雙層倒皿法 (double layer plating)，本次實驗使用到劃線法和塗佈法。
劃線法：四區劃線法，把混雜在一起的同一微生物群體用接種環在培養基表面通過分區劃線，而得到獨立分布的細菌，經培養後繁殖成單一菌落，把這種單一菌落當成待分離微生物的純種。劃線型式是將培養基表面分層四個面積不同的小區域進行劃線。第一區的面積最小，做為待分離菌的菌源區；第二、三區是稀釋過渡區；第四區是主要的觀察區，該區會出現大量的單一菌落。四區劃線法主要用於菌種分純，可以觀察菌落特徵，對混合菌進行分離，但不能用於菌落計數，但不能用於菌落計數。此分離法為目前最常使用的。
無菌塗佈法：消毒滅菌過的三角彎棒放在培養基上，另一手旋轉培養基，三角彎棒輕輕晃動，以抹平稀釋菌液。靜置培養後，菌落均勻散布培養基。此方法常用於菌體計數，可以觀察菌落特徵。接種前需梯度稀釋，吸收量較少，平板不乾燥時效果不好。
(二) 微生物的接種
用於研究檢定細菌的特性，讓單一細菌生長及增值，使用培養基以人工方式營造適合細菌生長的環境，一般接種類型分為以下五種，液體接種、洋菜斜面接種、深層接種、半固體接種和平板接種。此次實驗使用洋菜斜面接種和深層接種。洋菜斜面接種：試管放入固體培養基，經熔融及冷卻，形成斜面培養基。
深層接種：在保存厭氧菌種或研究微生物的動力時常採用此法。使用深層穿刺進行細菌接種時用筆直的接種針，垂直插入培養基，而非使用接種環。如果某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍生長。此方法多用於厭氣和兼性厭氣菌的菌種保存用途。
平板接種：使用固體培養基來培養細菌，能藉由菌落計數來較準確的計算樣品中細菌的數量，此方法的原理是各個細菌在適當的固體培養基上都可以形成一個清楚且容易辨別的菌落。分成三組，空氣組、拇指組、口腔組。空氣組，將空氣組培養皿放置室溫實驗室，暴露接觸空氣三十分鐘；會出現數個菌落且零星點狀分佈，中心顏色較白且微微突起。拇指組，先將拇指組培養皿畫線分為兩區域，一邊以未消毒過的拇指按壓，另一邊以消毒過拇指按壓；未經消毒的一側可見點狀菌落。口腔組，將舌頭放置口腔組的培養基上；菌落均勻分散舌頭接觸過的區域。
三、 材料與方法
(一) 微生物的接種
1. 劃線法：本次使用四區劃線法，先將接種環以酒精燈燒紅滅菌，待冷卻後，以接種環沾取少量菌液，於平板培養基的一邊做第一次平行劃線（約3~4條），作為第一區，接著接種環再以火燒紅，轉動培養皿約90度角，接種環冷卻後取少量第一區菌體，做第二次平行劃線，作為第二區，然後再重覆滅菌步驟通過第二次劃線部分做第三區，最後通過第三次平行劃線部分做第四區。利用接種環在培養基上逐次劃直線，使其達到逐漸稀釋之效果，劃線完畢後，蓋上培養皿蓋，以倒置方法置於37℃恆溫培養箱培養24小時後，進行觀察。2. 無菌塗佈法：取菌液直接滴於平板培養基上，接著將浸泡於酒精中之三角形塗棒取出，以酒精燈將酒精燃燒盡後，待冷卻，接著將塗棒輕放於培養基表面，以左手旋轉平板培養基，右手將塗棒前後推動，使菌液均勻塗佈於培養基表面，直至菌液被培養基吸收為止，最後蓋上培養皿蓋，以倒置法置於37℃恆溫培養箱培養24小時後，進行觀察。
3. 斜面劃線法：先將接種針以酒精燈燒紅滅菌，接著沾取菌液於斜面培養基上自管底往管口方向，沿著培養基表面以S形劃線，劃線完畢後，蓋上試管蓋，置於37℃恆溫培養箱培養24小時後，進行觀察。
4. 深層接種法：先將接種針以酒精燈燒紅滅菌，接著沾取菌液，於斜面培養基上筆直插入，再抽出接種針，接著蓋上試管蓋，置於37℃恆溫培養箱培養24小時後，進行觀察。
(二) 環境中的微生物
準備4個平板培養基，並編名為空氣組、口腔組、拇指組以及控制組，將空氣組培養基放置於空氣中30分鐘後蓋上蓋子。以舌頭沾舔口腔組培養基後迅速蓋上蓋子。將拇指組培養基分成兩部分，分別印上洗手前與洗手後的指印並蓋上蓋子。最後皆置於37℃恆溫培養箱培養24小時後，與控制組無菌培養基比較觀察。四、 結果
(一) 微生物的分離
1. 畫線法：利用接種針畫出四個區域，第一區寬度最粗且呈連續的線型分布；第二區前半段仍呈線型分布但至中後段就成不連續的點狀分布；第三區完全呈不連續的點狀分布；第四區只剩下零星的點狀分布。菌落顏色呈米黃色且不透明，形狀為圓形且邊緣平滑、中心微凸、表面平滑；氣味不好聞 (圖一、a)。2. 塗佈法：菌落均勻地呈現點狀並且密集分布在培養基表面上 (圖一、b)。
(二) 微生物的接種
1. 斜面接種：試管內的培養基表面上，畫出S痕跡的地方長出密集菌落 (圖二、a)。2. 深層接種：孔洞旁與凹陷處皆有米黃色的菌落 (圖二、b)。
五、 討論
實驗中，我們的操作手法上與助教有些不同。經討論過後我們認為這些不同，不影響實驗的結果，只是會影響操作的流暢度。例如：第一，在操作四區劃分法時，助教認為要來回折返且不能重疊地畫出各區域；而我們第一區的畫法是同方向畫出平行線，其他三區則是按照助教的方式。第二，在操作塗布法時，助教認為要一手旋轉培養皿，一手持三角彎棒小幅度前後位移；而我們一開始是一手固定培養皿，一手持三角彎棒順時針旋轉，後來則改成助教的方式。最後比較起來助教的方式確實都有比我們先前的方式順暢許多。斜面與深層接種皆有菌落的生成，可能是未知菌液內有多種菌體，包含好氧與厭氧菌，所以在深層接種實驗中，缺氧的底部或含氧的表面皆可觀察到菌落的生成；另一種可能是只有一種兼性厭/好氧菌。我們認為答案是後者，因為在四區劃線的結果，可以看出各個菌落的外型、顏色與大小無明顯差異，所以不會是有多種菌種存在於菌液中。
最後如果要辨別出此菌是兼性厭氧還是兼性好氧，則要再多觀察幾天，看菌落在表面與深層培養基擴張的程度。我們預測如果深層接種的實驗觀察越久，菌落在底層擴張較多，那它可能是兼性厭氧菌，反之則為兼性好氧菌。
當時我們有討論到為何在做微生物接種時，要用斜面培養基而非平面培養基。助教表示是為了增加表面積，才故意做斜面的設計。我們認為斜面的優點還有便於研究者觀察菌落於表面上生長的狀況。
六、 結論
由四區劃分法所得的結果可知，越後畫出來的區域，菌種分布越零星且各圓點大小相似。從圓點大小相似可判斷出每個菌落起初是由相似數量的細菌獨立分裂形成的菌落。第三區與第四區的圓點大小無顯著差異，可猜測從第三區開始的菌落是由單一隻細菌所分裂形成的。各個菌落邊緣與表面皆平滑，可判斷出此菌種是光滑型菌。斜面接種與深層接種皆可以看到有菌落的出現，菌落的分布是從接種針刺入處到底部皆有，我們認為此菌是兼性厭/好氧菌。因為結果發現此菌可在氧氣充足的表面存活，也可在氧氣較少的深層底部存活。
平板接種的結果顯示人的拇指與舌頭表面皆有微生物的存在，並且是密集的分布於人體表面上，只要與人體表面接觸過的布分皆能於一天內就培養出密集的菌落。空氣中也有微生物的存在，只是密度不像人體表面的微生物一樣密集。而在空氣組可見數個菌落中心白色的部分較明顯且側面觀察可見中心微微突起，可推測出中間可能集中較多的菌，且菌是從中心往外擴散開來。
---
ps. 大家好～我是筆者宗宗，接下來我會陸陸續續將我在大學時期的所見所聞寫成文章，並收錄於我自己的部落格（宗宗大學）。想看更多文章者，歡迎來我的部落格或粉專觀看，喜歡我的文章者歡迎按讚、追蹤、留言與分享，讓我知道 :)。
https://www.facebook.com/ttuniversity2
https://ttuniversity.blogspot.com
---
七、 參考文獻
- 張怡塘 (2009)，環境微生物實驗 (修訂版)，高立圖書有限公司，12、16頁。
- 王孟群 (1999)，實用微生物學實驗 (第二版)，九州圖書文物有限公司，193－196頁。
- Koch, Robert. 1880. Investigations into the Etiology of Traumatic Infective Diseases. The New Sydenham Society.
- Koch, Robert. 1878. Untersuchungen Über die Aetiologie der Wundinfectionskrankheiten. Leipzig: F.C.W. Vogel.
作者：歐湘鈴、呂宗霖、鄭書華、陳威行、黃子晴、李家儀、歐家滎、唐翊綾
留言
張貼留言